PARTICULARITATI ALE CICLULUI CELULAR LA NEURONI

Mihaela GHEORGHIU, Dan PRELIPCEANU, Constantin BARA

Rezumat
Foarte multe rezultate experimentale atesta implicarea concentratiilor mari de specii reactive de oxigen in aparitia bolilor neurodegenerative, chiar daca mecanismele prin care neuronii mor in conditii de stres oxidativ sunt, in majoritate, necunoscute. Rezultatele unor cercetari recente sugereaza ca unul dintre mecanismele prin care neuronii complet dife-rentiati mor este reintrarea lor aberanta in ciclul celular, fenomenul fiind dovedit la pacienti cu boala Alzheimer si sindromul Down, precum si pe modele experimentale de soareci cu boli neurodegenerative. Vom discuta unele descoperiri recente care privesc influenta stresului oxidativ asupra apoptozei si neurodegenerarii, precum si conexiunile posibile dintre stresul oxidativ si reintrarea aberanta in ciclul celular.
Cuvinte cheie:
ciclu celular (CC), stres oxidativ (SO), apoptoza, AIF (factorul inductor al apoptozei).
Abstract
While numerous studies have examined the role of increased reactive oxygen species in later-onset neurodegenerative disorders, the mechanism by which neurons die under conditions of oxidative stress remains largely unknown. Fairly recent evidence have suggested that one mechanism linked to the death of terminally differentiated neurons is aberrant reentry into the cell cycle. This phenomenon has been reported in Alzheimer disease patients, Down syndrome patients and several mouse neurodegenerative models. We will discuss some recent findings regarding the influence of oxidative stress on apoptosis and neurodegeneration and possible connections between oxidative stress and unscheduled cell cycle reentry.

Key words:
cell cycle , oxidative stress, apoptosis, apoptosis inducing factor.


Ciclul celular poate fi definit ca succesiunea de evenimente pe care le parcurge o celula intre doua diviziuni (mitoze). Conventional, ciclul celular este subimpartit in patru faze:
- G1 (gap phase 1): in aceasta faza, celula "se pregateste" pentru sinteza, controland integritatea structurii ADN, dimensiunile celulei, prezenta compusilor nutritivi si a factorilor de crestere;
- S (sinteza): este faza in care are loc replicarea ADN;
- G2 (gap phase 2), in care este verificata integritatea replicarii ADN;
- M (mitoza): faza de diviziune celulara. Cresterea celulara este deci o secventa de transformari care decurg de la G0-G1 la faza S si apoi la G2-M. Fazele G1 si G2 sunt denumite oarecum impropriu faze "gap", deoarece ele nu se caracterizeaza prin repaus, ci prin derularea unor "puncte de restrictie" extrem de importante pentru desfasurarea normala a ciclului celular. In functie de capacitatea de proliferare si de caracteristicile ciclului celular (CC), exista trei categorii de celule:

1. celule "labile" (se divid continuu) care intra permanent in ciclul celular pentru a inlocui celulele care au fost distruse. Exemple: celulele epiteliale din stratul scuamos al pielii, cavitatea bucala, celulele din canalele secretorii ale glandelor salivare, ale pancreasului, ale cailor biliare, celulele columnare din tractul gastrointestinal si uter, epiteliul tranzitional din caile urinare, celulele din maduva spinarii si tesuturile hematopoietice. Celulele nou-formate provin dintr-o populatie de celule stem, care au capacitate nelimitata de proliferare, iar celulele progenitoare se pot gasi in trepte diferite de diferentiere.
2. celule stabile ("quiescent cells") care au nivel scazut de replicare, dar, sub actiunea diferitilor stimuli, intra in diviziune rapida si pot sa reformeze tesuturile de origine. In conditii normale, aceste celule se afla in faza G0 a ciclului celular, dar dupa stimulare, pot intra in G1.

Exemple: celulele parenchimatoase din toate organele cu rol glandular (ficat, rinichi, pancreas), celulele mezenchimale (fibroblasti, celule musculare), celulele endoteliale. Chiar daca aceste prime doua tipuri de celule sunt capabile de regenerare, pentru reconstituirea unei structuri normale este necesara prezenta unei membrane bazale integre, care este, de fapt, esafodajul noii structuri parenchimatoase. Distrugerea membranei bazale determina o proliferare celulara dezorganizata.

3. celule care nu se divid, parasind ciclul celular, fara a mai intra in mitoze, in toata perioada postnatala. Exemple: neuronii, celulele musculare striate, miocardocitele. Neuronii distrusi din sistemul nervos central sunt inlocuiti prin proliferarea permanenta a celulelor gliale. Cele mai importante elemente implicate in derularea CC sunt factorii de crestere, care pot fi:

- factori de competenta: nu stimuleaza direct sinteza ADN, dar pregatesc celulele aflate in G0 sau G1 pentru aceasta sinteza;
- factori de progresie: stimuleaza sinteza ADN in celulele competente. In plus, majoritatea factorilor de crestere initiaza migrarea celulara, diferentierea si remodelarea tisulara. Derularea CC este controlata de semnale externe (factori de crestere si antimitogeni), in scopul de a integra diviziunea celulara cu necesitatile dictate de adaptarea la mediu.
Controlul ciclului celular se realizeaza la nivelul unor puncte de restrictie (punctele care controleaza tranzitia G1-S si tranzitia G2-M, precum si punctul de restrictie al asamblarii fusului mitotic) si presupune derularea unor mecanisme reglatorii care integreaza secventialitatea si temporalitatea etapelor ciclului celular. Se verifica, in acest mod, daca evenimentele critice, replicarea ADN si segregarea cromozomilor, sunt parcurse normal.
CC al neuronilor este controlat de aceleasi puncte de restrictie ca si in alte celule. Evenimentele trigger care declanseaza ciclul celular sunt reprezentate de modificarile concentratiei intracelulare si ale activitatii unui grup de proteine, numite cicline, care se asambleaza cu o categorie de protein kinaze constitutive, numite CDK (kinaze ciclin-dependente). Se formeaza complexe active, care fosforileaza proteine implicate in replicarea ADN, formarea fusului mitotic, etc. Neuronii sunt celule care nu se mai divid, parasind ciclul celular imediat dupa nastere. In perioada prenatala, precursorii neuronali traverseaza ciclul celular, cu aparitia unui numar de neuroni mai mare decat cel necesar. Ulterior, excesul de neuroni este eliminat prin apoptoza selectiva. Dupa diferentierea completa, neuronii raman in faza G0, fara a mai intra in ciclul celular. Celulele nervoase sunt rezistente la transformarea neoplazica, aspect dovedit prin faptul ca tumorile maligne cu punct de plecare in neuronii complet diferentiati sunt extrem de rare. Inducerea exprimarii fortate a oncogenelor in celulele complet diferentiate, inclusiv in neuroni, determina, mai degraba, moarte celulara decat transformare neoplazica (Feldersen si colab., 1992). Moartea celulara survine prin reintrarea aberanta a acestor celule in CC.

Argumente experimentale in favoarea afirmatiei anterioare stau urmatoarele: - tratarea neuronilor retinieni din culturi, aflati in faza postmitotica, cu factori de crestere (NGF - nerve growth factor, insulina, neurotrofina-3) determina apoptoza neuronala, cu intrare prealabila a acestora in CC. Dovada o constituie prezenta unei expresii crescute a ciclinei B2.
Tratarea acestor neuroni cu un inhibitor al CDK (roscovitina), deci un inhibitor al CC, blocheaza reintrarea in CC si apoptoza (Copani si colab., 2002). Aceste rezultate demonstreaza doua caracteristici ale comportamentului neuronal:
a) desi sunt celule complet diferentiate, aflate in faza postmitotica, cel putin o parte din neuroni isi mentin capacitatea de raspuns la factorii de crestere;
b) raspunsul acestor neuroni consta in apoptoza, precedata de o ultima intrare in CC.

- aceeasi intrare aberanta in CC, cu apoptoza consecutiva, a fost observata si la neuronii corticali ai embrionului de soarece, cand in cultura au fost adaugate concentratii toxice de -amiloid (Copani si colab., 1999). Acesti neuroni prezentau concentratii crescute ale markerilor de desfasurare a CC: ciclinele D1, A si E, precum si cresterea fosforilarii proteinei pRb. In plus, -amiloidul determina cresterea nivelului de ganglizid GD3, care este o componenta a caii de semnalizare a sfingolipidelor si care favorizeaza intrarea in CC si apoptoza (Copani si colab., 2002).
- si injuriile neurotoxice pot determina intrarea aberanta in CC si apoptoza. Astfel, tratarea celulelor cerebeloase cu acid kainic, agent neurotoxic, determina cresterea sintezei de CDK2, ciclina E si de factor de transcriptie E2F, precum si replicarea ADN (Verdaguer si colab., 2002). - reintrarea aberanta in CC si apoptoza caracterizeaza si neuronii umani de la pacienti cu boli neurodegenerative:
- la bolnavii cu sindrom Down, apoptoza neuronilor corticali survine dupa semnalizarea mitogenezei si a diferentierii. Neuronii piramidali hipocampici ai acestor bolnavi prezinta nivel crescut de CDK4, marker de desfasurare a CC, dar si degenerescenta granulo-vacuolara si aglomerari de neurofibrile (Rangathan, Bowser, 2003).
- neuronii motori spinali si corticali ai bolnavilor de scleroza laterala amiotrofica prezinta concentratii crescute de ciclina D1, CDK4, forma hiperfosforilata de pRb si factor de transcriptie E2F (pe preparate postmortem) (McShea si colab., 1997).
- neuronii hipocampici din preparate postmortem obtinute de la pacienti cu maladie Alzheimer, prezinta, de asemenea, concentratii mari de proteine ale CC: ciclinele D1, B, CDK4, PCNA (proliferating cell nuclear antigen) (Busser si colab., 1998; Herrup, Arendt, 2002).
- acesti neuroni prezinta frecvent aspecte de tetraploidie, ceea ce semnifica sinteza de ADN fara diviziune celulara si este un indicator de senescenta celulara (Nagy si colab., 1997). Puternic incriminat in aparitia poliploidiei este stresul oxidativ, care induce alterarea oxidativa a ADN.
- proteina Ki-67, asociata CC, a fost evidentiata in mai multe tipuri de tumori, dar si in neuronii pacientilor cu maladie Alzheimer, epilepsie a lobului temporal si boala Pick (Konishi si colab., 2002).
- legatura dintre reintrarea aberanta a neuronilor in CC si apoptoza acestora este sustinuta de fenomenul demonstrat recent ca proteina CDC2, reglator al CC, determina fosforilarea Bad, unul dintre elementele trigger ale apoptozei (Klein, Ackerman, 2003).

CONCLUZIE Semnalele mitogene exercitate asupra unor celule complet diferentiate determina cresterea sintezei proteinelor CC, cu intrarea aberanta a acestor celule in CC si apoptoza ulterioara. Majoritatea datelor experimentale incrimineaza stresul oxidativ (SO) ca principala cauza care induce intrarea aberanta a neuronilor in CC.
Recent, a fost descris un nou model genetic prin care se pot explica mecanismele prin care SO stimuleaza neuronii sa paraseasca G0 si sa reintre in CC (Klein, Ackerman, 2003). Acest model este reprezentat de soareci care prezinta mutatia Hq (harlequin), caracterizata prin insertia unui provirus leucemic in primul intron al genei pentru factorul inductor al apoptozei (AIF). Aceasta insertie determina imbinarea aberanta a provirusului cu exonul 1, ceea ce determina o scadere cu 80-90% a ARNm pentru AIF. In timp, acesti soareci dezvolta, printre alte patologii, degenerescenta cerebeloasa si retiniana (Klein si colab., 2002; Bronson si colab., 1990).
AIF este o flavoproteina ubiquitara, de 57 kDa, care contine o grupare prostetica FAD (Susin si colab., 1999). Domeniul COOH-terminal din AIF este voluminos si este similar ca structura cu anumite oxidoreductaze din plante si bacterii (Klein, Ackerman, 2003). Determinari ale structurii cristaline a AIF au scos in evidenta existenta unei zone glutation reductaza-like si o mare asemanare cu bifenil deoxigenaza (Susin si colab., 1999). In conditii normale, AIF este localizat in spatiul intermembranar mitocondrial, iar la declansarea apoptozei migreaza spre citoplasma si nucleu. In culturile de celule, apoptoza este declansata cand celulele sunt transfectate cu AIF caruia ii lipseste capatul NH2-terminal (zona tinta mitocondriala) sau cand se injecteaza in nucleu sau citoplasma un AIF recombinant (Mate si colab., 2002). Studii efectuate pe celulele mamiferelor au demonstrat ca activitatea apoptogenica a AIF este independenta de activitatea sa redox si nu este blocata de inhibitorii caspazelor (Miramar si colab., 2001; Wang si colab., 2002; Arnoult si colab., 2002).
Exista si alte studii, efectuate pe modele experimentale, care dovedesc ca descarcarea de AIF este caspazo-dependenta. Oricum, implicarea AIF in declansarea proceselor apoptotice este certa. In acest sens, s-a demonstrat pe embrioni ca evenimentele apoptotice care conduc la aparitia cavitatiilor (remodelarii) sunt AIFdependente (Joza si colab., 2001).
AIF are o mare omologie structurala cu glutation reductaza, de aceea se considera ca la soarecii Hq, scaderea severa a nivelului de AIF determina stres oxidativ, prin imposibilitatea ajustarii corecte a productiei de H2O2 (Klein, Ackerman, 2003).
Argument experimental in acest sens sta observatia potrivit careia la soarecii Hq s-au inregistrat cresteri ale activitatii catalazei (implicata in inactivarea H2O2) si nu ale superoxid dismutazelor. Excesul de H2O2 determina la acesti soareci acumularea de radicali OH., prin reactia Fenton, cu cresterea peroxidarii lipidice, proteice si a ADN. Desi AIF in concentratii mari poate induce SO, pentru anumite tipuri de celule, acest factor poate sa si protejeze celula in fata apotozei indusa de SO (Klein, Ackerman, 2003). Mecanismele posibile prin care AIF induce SO nu sunt foarte clare:

- AIF are activitate NAD(P)H oxidazica, deci ar putea genera anion superoxid. Aspectul a fost insa dovedit doar in vitro, fara a fi fost confirmat si in vivo (Miramar si colab., 2001)
- AIF are rol posibil in desfasurarea reactiilor lantului respirator mitocondrial, iar scaderea severa a AIF ar putea determina pierderi de electroni din mitocondrie, cu generare consecutiva de SRO (Lipton, Bossy-Wetzel, 2002). Aspectul ramane sa fie confirmat.
- AIF ar putea fi implicat in reactii de cuplare a reciclarii glutationului cu sistemul glutaredoxinei (Holmgren, 2000). Neuronii Hq mutanti reintra aberant in CC, cu cresterea sintezei de ADN, fenomen dovedit prin exprimarea PCNA (proliferating cells nuclear antigen) si a proteinei Cdc47, markeri ai fazei S. Nucleii acestor neuroni sunt insa picnotici, fara aspecte care sa sugereze mitogeneza, iar caspaza-3 este activata, ceea ce dovedeste desfasurarea apoptozei.
Aceste aspecte, impreuna cu evidentierea markerilor de SO, cu mult timp inainte de aparitia manifestarilor clinice ale bolilor neurodegenerative, confirma implicarea SO in reintrarea aberanta in CC si in declansarea apoptozei. Raspunsul la SO nu este insa acelasi pentru toti neuronii. Unii reintra in CC si mor prin apoptoza, altii mor fara sa fie necesara reintrarea in CC, iar altii supravietuiesc, devenind si mai rezistenti la SO (Klein si colab., 2002; White si colab., 1998).
Explicatia pentru acest comportament diferit nu este foarte clara, dar se pare ca este implicat si tipul neuronilor. Astfel, neuronii cerebelosi granulari sunt mult mai sensibili la SO decat neuronii corticali (Zhu si colab., 2000). Un alt argument in favoarea implicarii speciilor reactive de oxigen in controlul CC este dovedirea blocarii CC in faza G1, secundara acumularii proteinei p53 din timpul stresului oxidativ (Sugano si colab., 1995).
Se stie ca mitocondria reprezinta o sursa permanenta de specii reactive de oxigen, deci este si o sursa potentiala de disfunctie redox a celulei. Proliferarea mitocondriala este cel mai bine evidentiata in timpul perioadei tarzii a fazei S, in faza G2 si in mitoza. La neuroni, proliferarea mitocondriala survine atunci cand se inregistreaza anomalii ale CC care angajeaza celula spre apoptoza (Hirai si colab., 1998). Se poate afirma ca oprirea CC, in conditiile unui volum maxim mitocondrial, este evenimentul martor al unei agresiuni oxidative intense exercitata de mitocondrie, care depaseste capacitatea de adaptare si regenerare celulara. Putem concluziona ca diferentierea completa care caracterizeaza neuronii este un proces care confera scaderea receptivitatii la semnalele factorilor de crestere, persistand, ca element vestigial, un grad de competenta mitotica (Raina si colab., 1999).
Cand aceasta receptivitate scazuta la factorii neurotrofici dispare, neuronii vulnerabilizati reintra in CC, dar progresiunea nu este completa, ci conduce la o disfunctie severa, cunoscuta sub termenul de "abortosis" (Raina si colab., 2004). O caracteristica a acestei disfunctionalitati este prezenta simultana a unor markeri ai desfasurarii CC care caracterizeaza, in conditii normale, cate o singura etapa a CC. Neuronii care ajung la acest nivel de functionalitate au doar doua posibilitati de evolutie: apoptoza sau transformarea tumorala.

Bibliografie

1. Arnoult D si colab., (2002): Mitochondrial release of apoptosis- inducing factor occurs downstream of cytochrome c release in response to several proapoptotic stimuli, J Cell Biol 159: 923-929, [abstract][free full text]
2. Bronson RT si colab.,(1990): Harlequin (Hq) produces pregressive cerebellar atrophy, Mouse Genome 87: 110.
3. Busser J si colab., (1998): Ectopic cell cycle proteins predict the sites of neuronal cell death in Alzheimer’s disease brain, J Neurosci 18: 2801-2807, [abstract][free full text]
4. Copani A si colab. (1999): Mitotic signaling by beta-amyloid causes neuronal death, FASEB J 13: 2225-2234, [abstract][free full text]
5. Copani A si colab., (2002): Beta-amyloid-induced synthesis of the ganglioside GD3 is a requisite for cell cycle reactivation and apoptosis in neurons, J Neurosci 22: 3963-3968, [abstract][free full text]
6. Feddersen RM, (1992): Disrupted cerebellar cortical development and progressive degeneration of Purkinje cells in SV40T antigenic mice, Neuron 9: 955-966, [medline]
7. Herrup K, Arendt T, (2002): Re-expression of cell cycle proteins induces neuronal cell death during Alzheimer’s disease, J Alzheimers Dis 4: 243-247, [medline].
8. Hirai K si colab., (1998): Vulnerable neurons in Alzheimer disease accumulate mitochondrial DNA with the common 5kb deletion, J Neuropathol Exp Neurol 57:511.
9. Holmgren A, (2000): Antioxidant function of thioredoxin and glutaredoxin systems, Antiox Redox Signal 2: 811-820, [medline].
10. Joza N si colab., (2001): Essential role of the mitochondrial apoptosis-inducing factor in programmed cell death, Nature 410: 549-554, [medline]. 11. Klein AJ, Ackerman SL, (2003): Oxidative stres, cell cycle and neurodegeneration, J Clin Invest 111: 785-793, [abstract][free full text]
12. Klein AJ si colab., (2002), The harlequin mouse mutation downregulates apoptosis-inducing factor, Nature 419: 367-374, [medline]
13. Konishi Y si colab., (2002): Cdc2 phosphorylation of BAD links the cell cycle to the cell death machinery, Mol Cell 9: 1005- 1016,[medline].
14. Lipton SA, Bossy-Wetzel E, (2002): Duelling activities of AIF in cell death versus survival: DNA binding and redox activity, Cell 111: 147-150, [medline].
15. Mate MJ si colab., (2002): The crystal structure of the mouse apoptosis inducing factor, Nat Struct Biol 9: 442-446, [medline].
16. McShea A si colab., (1997): Abnormal expression of the cell cycle regulators P16 and CDK4 in Alzheimer’s disease, Am J Pathol 150: 1933-1939, [abstract].
17. Miramar MD si colab., (2001): NADH oxidase activity of mitochondrial apoptosis-inducing factor, J Biol Chem 276: 16391- 16398, [abstract][free full text].
18. Nagy Z si colab., (1997): Expression of cell division markers in the hippocampus in Alzheimer’s disease and other neurodegenerative conditions, Acta Neuropathol. (Berl) 93: 294-300, [medline].
19. Raina AK si colab., (1999b): Mitotic neurons: a dogma succumbs, Exp Neurol 159:248-249.
20. Raina AK si colab., (2004): Alzheimer’s disease and the cell cycle, Acta Neurobiol Exp 64: 107-112.
21. Rangathan S, Bowser R, (2003): Alterations in G1 to S phase cell-cycle regulators during amyotrophic lateral sclerosis, Am J Pathol 162: 823-835, [abstract][free full text]
22. Sugano T si colab., (1995): Nuclear accumulation of p53 in normal human fibroblasts is induced by various cellular stresses wich evoke the heat shock response, independently of the cell cycle, Jpn J Cancer Res 86: 415-418.
23. Susin SA si colab., (1999): Molecular characterization of mitochondrial apoptosis-inducing factor, Nature 397: 441-446, [medline].
24. Verdaguer E si colab., (2002): Kainic acid-induced apoptosis in cerebellar granule neurons: an attempt at cell cycle re-entry, Neuroreport 13: 413-416, [medline].
25. Wang X si colab., (2002): Mechanisms of AIF-mediated apoptotic DNA degradation in Caenorhabditis elegans, Science 298: 1587-1592, [abstract][free full text].
26. White AR si colab., (1998): Survival of cultured neurons from amyloid precursor protein knock-out mice against Alzheimer’s amyloid beta toxicity and oxidative stress, J Neurosci 18: 6207-6217, [abstract][free full text].
27. Zhu X si colab., (2000): Activation of oncogenic pathways in degenerating neurons in Alzheimer disease, J Neuropathol Exp Neurol 59: 880-888, [medline].

Sponsori si parteneri